藥物抗體比 (DAR)和藥物載量或 DAR 分布是 ADC 的兩個(gè)主要關(guān)鍵特性。 DAR值定義為與抗體綴合的藥物分子的平均數(shù)量。相反，藥物負(fù)載或 DAR 分布定義為抗體載體上存在的綴合藥物數(shù)量的化學(xué)計(jì)量分布。 DAR 值決定了 ADC 的功效和安全性。高 DAR 可能會(huì)阻礙 ADC 的藥代動(dòng)力學(xué)特性，而低 DAR 會(huì)顯著限制這些療法的效力。理想情況下，DAR 分布值應(yīng)在 2-4 之間。

已經(jīng)開發(fā)了幾種方法來以越來越高的精度測量這些特性。然而，這些系統(tǒng)固有的異質(zhì)性以及抗體載體中復(fù)雜的翻譯后修飾的存在使得這種表征在分析上具有挑戰(zhàn)性。

目前，這些屬性是使用以下方法測量的：

• 藥物與抗體的比率（平均DAR）：

• 紫外可見 (UV/Vis) 光譜

• 組織蛋白酶-B酶切法

• 載藥量分布：

• 毛細(xì)管電泳（CE）

• 關(guān)鍵屬性：

• 疏水相互作用色譜 (HIC)

• 反相高效液相色譜（RP-HPLC）

• 質(zhì)譜（MS）

用于 DAR 測定的紫外-可見 (UV/VIS) 光譜

紫外/可見光譜是用于 ADC 表征的方法。該方法傳統(tǒng)上用于確定蛋白質(zhì)濃度，它依賴于測量不同波長 (λ) 下的吸光度。該方法的先決條件是：（i）有效負(fù)載必須具有紫外/可見發(fā)色團(tuán)； (ii) 抗體和有效負(fù)載應(yīng)具有特點(diǎn)的最大吸光度波長（λ最大值，前者通常為 280 nm）； (iii) 藥物不得干擾抗體的吸收光譜，反之亦然。

如果 ADC 符合所有先決條件，則可以根據(jù)吸光度值和消光系數(shù)計(jì)算兩種組分的濃度。隨后，平均 DAR 可以簡單地通過將平均藥物濃度除以平均抗體濃度來估計(jì)。

盡管這種方法通常用于估計(jì) ADC 的 DAR，但它存在重要的局限性。例如，ADC 樣品中游離藥物的存在可能導(dǎo)致 DAR 值的高估。此外，紫外/可見光譜不提供任何有關(guān)藥物負(fù)載分布的信息，而藥物負(fù)載分布是一個(gè)同樣重要的特性。因此，該方法保留用于常規(guī)質(zhì)量控制操作，并且在新 ADC 的早期開發(fā)過程中很少使用。

用于 DAR 測定的組織蛋白酶 B 酶切法

組織蛋白酶 B 是一種溶酶體酶，負(fù)責(zé)用肽接頭切割 ADC 構(gòu)建體。最近開發(fā)了基于組織蛋白酶 B 的 DAR 測定酶法。該方法涉及使用多種酶和還原劑進(jìn)行一系列處理，以允許結(jié)合藥物的釋放。隨后通過色譜分離對處理后的游離藥物進(jìn)行定量。

ADC 首先用IdeS 蛋白酶預(yù)處理，產(chǎn)生 F(ab')2 和 Fc 片段，然后用2-巰基乙胺(2-MEA) 還原，以進(jìn)一步裂解為 Fd?、Fc 和 Lc。這種復(fù)雜的預(yù)處理可確保更好地進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)并更有效地切割有效負(fù)載。在這些步驟之后，用組織蛋白酶 B進(jìn)行消化，然后通過 RP-HPLC-UV 進(jìn)行蛋白質(zhì)組分的分離。

由于兩種組分在藥物定量之前被分離，因此該方法克服了 UV/Vis 方法所施加的最常見限制 -藥物和抗體組分需要不同的 λ 最大值。此外，這種方法也被認(rèn)為比質(zhì)譜法更精確，質(zhì)譜法的質(zhì)量信號(hào)通常會(huì)受到疏水性和凈蛋白質(zhì)電荷的影響，而疏水相互作用色譜 (HIC)在分析隨機(jī)綴合的 ADC 時(shí)可能會(huì)受到分辨率效率低的影響。

基于組織蛋白酶 B 的方法最重要的限制是無法辨別藥物負(fù)載分布。此外，由于該方法的復(fù)雜性，其用于質(zhì)量控制目的的實(shí)施仍然具有挑戰(zhàn)性。因此，該方法在早期開發(fā)或抗體研究環(huán)境中仍然更有用。

用于藥物載量分布測定的毛細(xì)管電泳 (CE)

毛細(xì)管電泳（CE）具有儀器簡單、規(guī)格小型化、分離高效快速、進(jìn)樣量少、分辨率高等特點(diǎn)。已經(jīng)測試并實(shí)施了不同的 CE 方法來表征 ADC，包括毛細(xì)管凝膠電泳 (CE-SDS)、毛細(xì)管等電聚焦 (cIEF)、成像 cIEF (iCIEF)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (CZE) 和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法 ( CE-MS）。所有這些方法都為 ADC 提供了不同級(jí)別的表征，例如異構(gòu)體、乙二醇分析和翻譯后修飾等。

與基于組織蛋白酶 B 的方法一樣，CE 方法也是最近才開發(fā)出來的。因此，很少有文獻(xiàn)可以支持他們。然而，在這些方法中，iCIEF 始終取得了有希望的結(jié)果。該技術(shù)允許根據(jù) ADC 電荷變體的等電點(diǎn) (pI) 對其進(jìn)行分離。通過這種方式，可以有效分離未結(jié)合的抗體和具有不同載藥量的不同 ADC 種類，有助于監(jiān)測批次間的一致性、載藥量分布和未結(jié)合的抗體。其缺點(diǎn)是該技術(shù)僅在基于賴氨酸的綴合 ADC 上進(jìn)行了測試。因此，目前尚不清楚它是否可以應(yīng)用于其他共軛化學(xué)。

用于詳細(xì) DAR 分析的疏水相互作用色譜 (HIC)

疏水相互作用色譜 (HIC) 的工作原理是在疏水固定相上運(yùn)行反鹽梯度。固定相根據(jù)樣品成分的疏水性保留和分離樣品成分，并且由于該方法使用溫和的條件，因此在分析過程中保留了復(fù)雜蛋白質(zhì)種類的天然構(gòu)象。因此，HIC 方法可用于測量平均 DAR并確定ADC 中的藥物負(fù)載分布。

在分析非共價(jià)蛋白綴合物（例如半胱氨酸連接的 ADC）時(shí)，溫和條件的使用使得該技術(shù)極其方便。這些綴合物通常在 RPLC（反相液相色譜）等更嚴(yán)格的色譜方法中解離，使得 HIC 成為這些生物藥物詳細(xì) DAR 分析的參考技術(shù)。

HIC 技術(shù)在分析基于賴氨酸和位點(diǎn)特異性的綴合 ADC 時(shí)效率相當(dāng)?shù)?。此外，該技術(shù)分離未結(jié)合分子的能力仍然有限，因?yàn)檫@些物質(zhì)僅被部分解析。然而，由于最近開發(fā)了新的色譜柱和分離方案，HIC 仍然是半胱氨酸連接 ADC藥物載量分布分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

用于詳細(xì) DAR 分析的反相高效液相色譜 (RP-HPLC)

反相高效液相色譜 (RP-HPLC) 廣泛用于表征藥物蛋白質(zhì)。與基于 HIC 的表征相比，RP-HPLC 的優(yōu)點(diǎn)是由于流動(dòng)相的揮發(fā)性，該方法與質(zhì)譜法的兼容性。相比之下，HIC 使用與 MS 研究不相容的鹽梯度。 RP-HPLC 或簡稱 RPLC（反相液相色譜）作為分析平均 DAR、載藥量分布、未綴合抗體和游離藥物接頭種類的方法有著成功的記錄。

對于半胱氨酸連接的 ADC，RPLC 是 HIC 的最合適替代品，可用于詳細(xì)的 DAR 分析。然而，該方法的主要缺點(diǎn)之一源自已知會(huì)破壞半胱氨酸連接的 ADC 天然構(gòu)象的惡劣分析條件，通常導(dǎo)致輕鏈和重鏈解離。為了克服這一限制，ADC 通常在分析前用還原劑進(jìn)行預(yù)處理。在這種情況下，輕鏈和重鏈更容易分離和單獨(dú)評估?；蛘撸珹DC 也可以用 IdeS 進(jìn)行預(yù)處理并進(jìn)行化學(xué)還原以生成 Fc、LC 和 Fd 片段。

無論 RPLC 中 ADC 分析所用的方案如何，尋找合適的色譜條件仍然具有挑戰(zhàn)性。對于賴氨酸連接的 ADC，RPLC 分離提供的分辨率通常不足以區(qū)分具有不同載藥量的完整 DAR 種類。因此，該方法對于平均 DAR 測定有效，但在分析賴氨酸連接 ADC 中的藥物負(fù)載分布時(shí)具有挑戰(zhàn)性。相比之下，位點(diǎn)特異性綴合 ADC 可以通過 HPLC 或基于 HIC 的方法輕松分析。

一般來說，獨(dú)立于綴合化學(xué)（半胱氨酸、賴氨酸或位點(diǎn)特異性），RPLC 可以作為平均 DAR 質(zhì)量控制的可靠方法，并且對于檢測雜質(zhì)的存在非常有用。此外，RPLC 方法可用于估計(jì) ADC 穩(wěn)定性并量化游離藥物分子，使其可用于新型 ADC 的廣泛早期表征及其生產(chǎn)工藝的優(yōu)化。

用于詳細(xì) DAR 分析的質(zhì)譜 (MS)

質(zhì)譜 (MS) 分析取決于分析物的電離效率，并包含多種強(qiáng)大的高分辨率技術(shù)。目前用于分析大生物分子的 MS 光譜儀使用電噴霧電離 (ESI)結(jié)合飛行時(shí)間 (TOF)或Orbitrap，這有助于不同 ADC 物種在還原或非還原條件下獲得高分辨率。

由于這些方法的敏感性，通常建議用 PNGase F 預(yù)處理 ADC，以消除 N-聚糖引起的異質(zhì)性，N-聚糖通常會(huì)掩蓋或干擾 MS 分析。流行的替代方案包括將 ADC 還原為重鏈和輕鏈、抗體載體的酶促片段化或兩者的組合。此外，對于通常電離效率特別低的賴氨酸連接的 ADC，研究人員已成功去除有效負(fù)載的疏水部分，成功提高了檢測靈敏度。

預(yù)處理通常可以對 ADC 進(jìn)行更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)分析，包括以高精度和靈敏度檢測低豐度 ADC 物種。

結(jié)束語

本文涵蓋的所有不同方法都應(yīng)被視為互補(bǔ)的。事實(shí)上，使用不同方法獲得的結(jié)果的比較有助于在平均 DAR、藥物負(fù)載分布、未綴合抗體含量和游離有效負(fù)載連接體含量方面獲得更準(zhǔn)確的 ADC 分子指紋。此外，大多數(shù)這些技術(shù)的性能和準(zhǔn)確性在很大程度上取決于共軛化學(xué)。因此，在早期開發(fā)過程中應(yīng)使用多種方法來確保這些生物藥物的正確和廣泛的表征。

盡管基于質(zhì)譜的方法在分辨率方面仍然是好的，但將其用于常規(guī)質(zhì)量控制通常并不可行。因此，通常應(yīng)選 HIC 或 CE 等替代方法來加快 ADC 生產(chǎn)和質(zhì)量控制。