中性木聚糖酶測試盒（比色法）/中性半纖維素酶測試盒（比色法）

測定意義：

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物產生，能催化水解木聚糖，也被稱為戊聚糖酶或半纖維素酶，可分解釀造或飼料工業(yè)中的原料細胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進有效物質的釋放，以及降低飼料中的非淀粉多糖，促進營養(yǎng)物質的吸收利用，因而廣泛的應用于釀造和飼料工業(yè)中，NEX一般分離自最適生長pH為6-8的微生物。

測定原理：

NEX在中性環(huán)境中催化木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，在沸水浴條件下進一步與3,5-二硝基水楊中發(fā)生顯色反應，在540nm處有特征吸收峰，反應液顏色的深淺與酶解產生的還原糖量成正比，通過測定反應液在540nm吸光值增加速率，可計算NEX活力。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、恒溫水浴鍋，可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

緩沖液：液體65mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。（若出現(xiàn)白色絮狀或顆粒狀沉淀，可60℃加熱溶解后使用）。

試劑二：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。

粗酶提取：

1. 發(fā)酵液：發(fā)酵液于8000g，4℃，離心15min，取上清，作為待測樣品。

2. 酶干粉：稱約0.1mg，加1mL緩沖液溶解待測。

3. 組織樣本：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL緩沖液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心10min，取上清待測。

測定操作表：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節(jié)波長至540nm。

2. 操作表

NEX計算公式：

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 1.6904x + 0.0058，R2 = 0.9989

1. 按液體體積活力計算：

酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個中性木聚糖酶的活力單位。

NEX活力（nmol/min/mL）= （ΔA-0.0058）÷1.6904÷150÷T×稀釋倍數×106

= 657× (ΔA-0.0058)

2. 按蛋白濃度計算：

酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個中性木聚糖酶的活力單位。

NEX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA -0.0058）÷1.6904÷150÷T×稀釋倍數×106÷Cpr

= 657×(ΔA -0.0058 ) ÷Cpr

3. 按鮮重計算：

酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個中性木聚糖酶的活力單位。

NEX活力（nmol/min/g鮮重）= （ΔA -0.0058）÷1.6904÷150÷T×稀釋倍數×106÷W

= 657×(ΔA -0.0058 ) ÷W

150：木糖的分子量；T：反應時間，30min；稀釋倍數=V反總÷V樣=300µL÷60µL=5；

106：轉化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.8452x + 0.0058，R2 = 0.9989

1. 按液體體積活力計算：

酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫升液體樣本每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個中性木聚糖酶的活力單位。

NEX活力（nmol/min/mL）= （ΔA-0.0058）÷0.8452÷150÷T×稀釋倍數×106

= 1315× (ΔA-0.0058)

2. 按蛋白濃度計算：

酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個中性木聚糖酶的活力單位。

NEX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA -0.0058）÷0.8452÷150÷T×稀釋倍數×106÷Cpr

= 1315×(ΔA -0.0058 ) ÷Cpr

3. 按鮮重計算：

酶活定義：50℃，pH6.0條件下，每克樣本每分鐘分解木聚糖產生1nmol 還原糖所需的酶量為一個中性木聚糖酶的活力單位。

NEX活力（nmol/min/g鮮重）= （ΔA -0.0058）÷0.8452÷150÷T×稀釋倍數×106÷W

= 1315×(ΔA -0.0058 ) ÷W

150：木糖的分子量；T：反應時間，30min；稀釋倍數=V反總÷V樣=300µL÷60µL=5；

106：轉化因子，即1mg/mL=106ng/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

注意事項：

1. 吸光度變化應該控制在0.01~0.8之間，否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計算公式中參與計算的稀釋倍數要相應改變；也可以延長或者縮短反應時間。

2. 試劑盒2-8℃保存，保質期3個月，建議盡快使用。

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