Fluoro-Gold

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美國 Fluorochorome 公司于1985 年成立于美國科羅拉多州丹佛市，Fluorochorome 一直 致力于熒光染料的研究與開發(fā)，其產(chǎn)品Fluoro Gold（熒光金）自 1985 年來在全球范圍 內(nèi)被廣泛應(yīng)用，并有大量的參考文獻(xiàn)。同時(shí)，F(xiàn)luorochrome公司特別開發(fā)了高靈敏度的 Fluoro-Gold Antibody 、以及 Fluoro-Ruby（紅色熒光金）等產(chǎn)品，F(xiàn)luorochrome 公司堅(jiān) 持以優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和熱情的服務(wù)贏得了良好的口碑。

小鼠右頸髓 DAPI染色縱切面的顯微照片，展示了典型的熒光金標(biāo)記運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元柱。圖片最初發(fā)表于Tosolini AP、Mohan R、MorrisR(2018)。以小鼠前肢運(yùn)動(dòng)終板區(qū)域的全長為目標(biāo)可增加熒光金進(jìn)入相應(yīng)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的吸收。Front.Neurol. 4:58, 1-10,4

大鼠前肢中強(qiáng)陽性熒光金標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。圖片最初發(fā)表于 TosoliniAP,Mohan R(2012)。大鼠前肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元柱的空間特征。神經(jīng)科學(xué)200:19-30,22.

成年小鼠腰椎脊髓的顯微照片，顯示了用 DAPI復(fù)染的熒光金標(biāo)記的典型柱狀圖。圖片最初發(fā)表于 MohanR, Tosolini AP, Morris, R.(2014)。神經(jīng)科學(xué) 274:318-330,323

1.背景

熒光金的使用方法與其他熒光示蹤劑基本相同，但在注射后存活時(shí)間、濃度范圍、組織處理以及與其他組織化學(xué)技術(shù)的兼容性方面，熒光金更為靈活。

2.儲(chǔ)存和保質(zhì)期

干熒光金應(yīng)存放在4 攝氏度的避光密閉容器中。妥善儲(chǔ)存后，熒光金的保質(zhì)期應(yīng)超過一年。溶液中的染料也應(yīng)存放在4 攝氏度的避光密閉容器中，并應(yīng)保持穩(wěn)定至少六個(gè)月。

8.載體

Fluoro-Gold 可溶于蒸餾水或 0.9%鹽水。Fluoro-Gold 在堿性 pH 下不溶解。但它也可以用作0.2M 中性磷酸鹽緩沖液中的懸浮液。

4.染料濃度

氟金已成功應(yīng)用于濃度范圍為 1-10%的染料。最初建議使用 4%的濃度。如果注射部位發(fā)生不良?jí)乃?，或?biāo)記太強(qiáng)烈，請(qǐng)將濃度降低至 2%溶液。如果您需要使用更精確的測量方法，氟金的分子量為532.6 道爾頓。

5.染料管理

·A.壓力注射 -這可能是常用的應(yīng)用模式。注射量范圍為 0.05-1 μl，通常為 0.1-0.2 ml。

B.離子電滲療法 --通過 4-10 秒脈沖離子電滲療法(+5 至 +10ua/10 分鐘)應(yīng)用，可產(chǎn)生離散、小注射部位。

C.晶體-示蹤劑晶體可以通過微量移液器的頭端注入。

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6.術(shù)后存活期

觀察到良好的逆行標(biāo)記，存活期從兩天到兩個(gè)月不等。存活期通常為三到五天。較長的存活期可增強(qiáng)遠(yuǎn)端突起的填充，而不會(huì)使染料從細(xì)胞中擴(kuò)散。

7.固定

幾平任何固定劑都可以使用，也可以不用固定劑，通常使用含4%用醛的磷酸鹽中性緩沖鹽水。含有高濃度重金屬(如鋨、示)的固定劑會(huì)淬滅熒光，而高濃度(超過1%)的戊二醛可能會(huì)增加背景熒光

8.組織化學(xué)處理

含有熒光金的組織幾乎可以根據(jù)任何常見的組織學(xué)技術(shù)進(jìn)行處理。這包括未固定組織的低溫切片(10mm)、固定組織的冷凍切片(20um)以及從嵌入塑料(0.2-4 mm)或石蠟(3-10 mm)的組織中切下的薄切片。固定組織的冷凍切片*常用。

9.組合方法

在此處理階段，可對(duì)切片進(jìn)行進(jìn)一步處理以獲得第二種標(biāo)記物，例如放射自顯影、HRP組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、第二種熒光示蹤劑、熒光復(fù)染劑等。

10.封片、透明化和蓋玻片

切片通常封片在明膠包被的載玻片上，風(fēng)干，浸入二甲苯中，并用無熒光 DPX塑料封片劑蓋玻片。切片可用分級(jí)酒精脫水，除非這與第二種示蹤劑不兼容。如果要將 Fluoro-Gold 與熒光免疫細(xì)胞化學(xué)相結(jié)合，則切片要風(fēng)干，并用中性緩沖中甘油(1:2)直接蓋玻片。

11.檢查和攝影

熒光金可使用帶寬帶紫外線激發(fā)濾光片的熒光顯微鏡進(jìn)行可視化。當(dāng)用中性 pH 緩沖液處理組織時(shí)，會(huì)發(fā)出金色，而當(dāng)用酸性(例如pH 3.3)pH 緩沖液處理組織時(shí)，會(huì)發(fā)出藍(lán)色?？梢杂脭?shù)碼或膠片拍攝(彩色照片使用 Ektachrome 200-400 ASA膠片，黑白照片使用速度相當(dāng)?shù)哪z片，例如 Tri-X)。大多數(shù)曝光時(shí)間范圍為 10-60 秒，具體取決干物鏡放大倍數(shù)和標(biāo)記強(qiáng)度。三十 (80)秒曝光時(shí)間約為平均值?？梢岳枚啻纹毓馔瑫r(shí)可視化熒光金和另一種示蹤劑。因此，紫外線與明場照明相結(jié)合，可在放射自顯影中同時(shí)定位熒光金與 HRP或銀顆粒。同樣，藍(lán)光激發(fā)也可結(jié)合使用，以品現(xiàn) FITC,的綠色發(fā)射顏色，而綠色激發(fā)光可用于同時(shí)觀察碘化丙啶或溴化乙錠(熒光復(fù)染劑)的紅色發(fā)射顏色。

載體

對(duì)于通過微量注射器或微量移液器進(jìn)行壓力注射，應(yīng)將氟金溶解在蒸餾水或 0.9%鹽水中。氟金也可用作 0.2M 中性磷酸鹽緩沖液中的懸浮液，但懸浮顆粒可能會(huì)堵塞細(xì)小的微量移液器頭端，因此蒸餾水或 0.9%鹽水是載體。對(duì)于離子電滲療法，在 0.1M 醋酸鹽緩沖液(pH=3.3)中配制 1% 氟金溶液。清潔干凈的(95%乙醇、水)玻璃微量移液器頭端應(yīng)為 10-20 mm。最佳離子電滲療法參數(shù)為+1 至 +5u 安培，脈沖電流(開啟 4-10 秒，關(guān)閉 4-10 秒)持續(xù) 10-20 分鐘。

注射部位

幾乎任何中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)都可以注射熒光金，以分析逆向運(yùn)輸。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，可以研究神經(jīng)節(jié)和周圍靶標(biāo)。對(duì)于周圍神經(jīng)的研究，應(yīng)切斷或損壞神經(jīng)，然后將其浸入或注射5%的熒光金溶液中。由于完整的通道纖維不能大量吸收熒光金，因此必須切斷或嚴(yán)重?fù)p壞纖維才能吸收染料。

運(yùn)輸和生存時(shí)間

熒光金被用作逆向軸突示蹤劑，盡管確實(shí)存在順向軸突運(yùn)輸。存活時(shí)間應(yīng)該有所不同(尤其是 12 小時(shí)-2 天的非常短的存活時(shí)間)，以最大限度地提高所研究的特定神經(jīng)系統(tǒng)中的順向運(yùn)輸。對(duì)干逆向運(yùn)輸，存活時(shí)間應(yīng)該從 4天到 14 天不等。7到 10 天適用于大多數(shù)系統(tǒng)，盡管長通路(例如脊髓到腦干)和大型哺乳動(dòng)物(例如貓、猴子)的通路可能需要更長的存活時(shí)間(例如 14 天)。此外，由于熒光金在逆向標(biāo)記的神經(jīng)元內(nèi)保持快速，因此數(shù)月的存活時(shí)間也會(huì)產(chǎn)生優(yōu)異的效果。對(duì)于離子電滲療法，建議存活時(shí)間為 2-5天。據(jù)估計(jì)，哺乳動(dòng)物每天的運(yùn)輸速度約為2厘米;對(duì)于冷血?jiǎng)游飦碚f，它的速度比較慢。

組織處理

組織處理在使用指南和原始出版物中有詳細(xì)介紹(Schmued and Fallon，1986，Brain Research 877:147-154)。由于熒光金在許多溶劑中都很穩(wěn)定，并且在逆向標(biāo)記的神經(jīng)元中保持穩(wěn)定，因此它的使用與許多組織化學(xué)技術(shù)兼容。它可以與其他逆向示蹤劑、免疫熒光、PAP 和 ABC免疫細(xì)胞化學(xué)、HRP組織化學(xué)、放射自顯影、復(fù)染(溴化乙錠是*選的熒光復(fù)染)、石蠟包埋和塑料包埋一起使用。但是，如果組織未固定，在水溶液中對(duì)組織進(jìn)行額外處理超過一兩個(gè)小時(shí)將導(dǎo)致標(biāo)記神經(jīng)元的熒光金熒光消失。熒光金可能在電子顯微鏡中有用。熒光金可用于已切片并轉(zhuǎn)移到磷酸鹽緩沖液的大腦。切片通常安裝在明膠包被的載玻片上，風(fēng)干，浸入二甲苯中，并用 DPX塑料封片劑蓋上(FLUKA Chemical Corp.,255 Oser Avenue，Hauppauge，NewYork，11788，目錄號(hào)44581)。組織也可以在載玻片上觀察而無需進(jìn)一步處理，可以通過分級(jí)酒精進(jìn)行脫水，或者，對(duì)于免疫細(xì)胞化學(xué)，可以將切片風(fēng)干并直接用中性緩沖中甘油(1:2)蓋上。

檢查和攝影使用寬帶紫外線(UV)激發(fā)濾光片，在熒光顯微鏡下觀察熒光金。使用與在寬帶紫外線下激發(fā)的其他熒光逆行示蹤劑相同的濾光片組(例如，真藍(lán)、快藍(lán)、核黃)，例如 Leitz Ploem 濾光片系統(tǒng) A(寬帶紫外線、激發(fā)濾光片 BP 340-380)、鏡面 RKP 400、屏障濾光片 1P430)。應(yīng)專門為熒光顯微鏡制作物鏡(例如蔡司制造的物鏡)、甘油或水。由于塑料會(huì)吸收紫外線，因此不建議通過塑料培養(yǎng)皿等觀察。推薦的膠片是 T-Max(柯達(dá)，黑白)和 Ektachrome 200(柯達(dá)，彩色幻燈片)。曝光時(shí)間通常為 20 秒到 1.5分鐘。

Fluoro-Gold (Fluorogold)是 Fluorochrome,LLC 的*家產(chǎn)品。它由 Fluorochrome 銷售，自1985 年以來被廣泛使用。其他公司正在銷色他們聲稱與Fluoro-Gold 相同或等同的產(chǎn)品。這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與Fluoro-Gold 不同，并且這些化合物的某些物理性質(zhì)可能非常不同。

“注意:熒光金、熒光金抗體和熒光紅寶石僅供安驗(yàn)室研光動(dòng)物或體外試驗(yàn)研究使用。不可用于人體。這些藥物應(yīng)僅供定期從事神經(jīng)解部學(xué)研充和體外試驗(yàn)或僅用于安驗(yàn)室研充的動(dòng)物的人員使用。

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